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關于染色質免疫共沉淀ChIP實驗原理及實驗總結

ChIP實驗原理

 

在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA復合物,并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。

可以利用ChIP研究轉錄因子( transcription factor, TF)與啟動子(promoter)的關聯性。由于ChIP采用甲醛固定活細胞或者組織的方法,所以能比較真實的反映細胞內TF與Promoter的結合情況。這個優勢是EMSA這個體外研究核酸與蛋白相互結合的實驗方法所不能比擬的。當用甲醛處理時,相互靠近的蛋白與蛋白,蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產生共價鍵。細胞內,當TF與Promoter相互結合(生物意義上的結合)時,它們必然靠的比較近,或者契合在一起,這個時候用甲醛處理,能使它們之間產生共價鍵。

一般ChIP的流程是:甲醛處理細胞——收集細胞,超聲破碎——加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合——加入Protein A,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,并沉淀——對沉淀下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合——洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物——解交聯,純化富集的DNA-片斷——PCR分析。

 

 

ChIP實驗步驟

第一天:
(一)、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。
1、取出1平皿細胞(10cm平皿),加入243ul 37%甲醛,使得甲醛的終濃度為1%。(培養基共有9ml)
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯:加甘氨酸至終濃度為0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中?;煸群?,在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養基,用冰冷的PBS清洗細胞2次。
5、細胞刮刀收集細胞于15ml離心管中(PBS依次為5ml,3ml和3ml)。預冷后2000rpm 5min收集細胞。
6、倒去上清。按照細胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。
假設MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
將2管混在一起,共800ul。
7、超聲破碎:VCX750,25%功率,4.5S沖擊,9S間隙。共14次。當然,如果實驗室有Bioruptor這種神器的話那就輕松了。



(二)、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結束后,10,000g 4度離心10min。去除不溶物質。
留取300ul做實驗,其余保存于-80度。
300ul中,100ul加抗體做為實驗組;100ul不加抗體做為對照組;100ul加入4ul 5M NaCl (NaCl終濃度為0.2M),65度處理3h解交聯,跑電泳,檢測超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產物中,加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉混勻1h。
10、1h后,在4度靜置10min沉淀,700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul 抗體,另一管中則不加抗體。4度顛轉過夜。

(三)、檢驗超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎后產物,加入4ul 5M NaCl,65度處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

第二天:
(一)、免疫復合物的沉淀及清洗。
12、孵育過夜后,每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度顛轉2h。
13、4度靜置10min后,700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟:加入溶液,在4度顛轉10min,4度靜置10min沉淀,700rpm離心1min,除去上清。
洗滌溶液:a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完畢后,開始洗脫。洗脫液的配方:100ul 10%SDS, 100ul 1M NaHCO3, 800ul ddH2O,共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer,室溫下顛轉15min,靜置離心后,收集上清。重復洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl終濃度為0.2M)。
混勻,65度解交聯過夜。

第三天:
(一)、DNA樣品的回收
17、解交聯結束后,每管加入1ul RNaseA(MBI),37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris.HCl(PH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度處理2h。
19、DNA片段的回收―――omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ul ddH2O。

(二)、PCR分析

 

ChIP技術總結
(一)、關于細胞
細胞的生長狀態要好。因為細胞的生長狀態直接影響細胞內部的基因表達調控網絡,也很有可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結合。
一般細胞長到75%-80%比較好。

(二)、關于抗體!
抗體是實驗成敗的致命因素之一!必須是IP級別的抗體,另外如果經濟條件許可的話,盡量買大廠的抗體。不推薦國產抗體和santa cruz的抗體,即使是IP級別的。
單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強,背景低。但是單抗有一個致命的弱點,就是識別位點單一,而在ChIP甲醛交聯的過程中,很有可能該位點被其它蛋白或核酸結合而被封閉,導致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有這個問題,但是多抗特異性較差,背景可能會偏高。
一般而言,如果沒有十足把握(單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結合的區域),選擇多抗比較穩妥一些。

(三)、關于交聯與超聲破碎!
這一塊的確是ChIP實驗中比較難把握的部分。交聯的程度會影響到超聲破碎的效果,交聯的程度越高,超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。
交聯不充分,只有一部分靶蛋白與其Promoter相結合,富集得到的Promoter的量不高,實驗假陰性。交聯過充分,基因組上結合了太多的蛋白,對超聲破碎造成障礙。另外也會增加背景。
一般來講,按照我的經驗,交聯條件取決于細胞類型。不同的細胞系,交聯的條件也不一樣。例如:NIH-3T3的交聯條件是室溫(25攝氏度)下15min,1%的甲醛濃度,而別的細胞系則可能完全不一樣。而超聲破碎的條件,機器不一樣,條件也不一樣。當然如果你有bioruptor這樣的神器,那么超聲破碎對你而言就是小菜一碟了。
一般,理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范圍也是可以接受的。

(四)、關于操作
希望盡可能的保持低溫(4度)。
沉淀的時候可以先在4度放置一會,等它自然沉降一些,再超低轉速(500rpm等)離心使其完全沉降。
雖然說明書上說ChIP實驗的過程中有幾個可以停頓的地方,我還是希望你能夠連續把它做完,直到PCR結果出來為止。盡量避免實驗中不可預知的影響因素。

(五)、關于解交聯
雖然說明書上說4小時已經足夠,但是我還是希望你可以解交聯過夜。因為在那樣的環境里,DNA不會降解,過夜解交聯更充分些。只是不要忘記在EP管口封上封口膜。
(六)、關于DNA片段的回收
需要注意的是:樣品中SDS樣品較高,普通的PCR產物回收試劑盒回收,很有可能會在最終的樣品中混入SDS,影響PCR實驗結果。
小Tip:過柱前,在樣品中加入一定量的異丙醇,能有效的消除SDS沉淀。

 

 
 
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