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什么是染色質免疫共沉淀技術(ChIP)?


染色質免疫沉淀(ChIP)實驗指南及技術總結

是一項比較流行的研究轉錄因子(transcriptionfactor,TF)與啟動子(promoter)相互結合的實驗技術。由于ChIP采用甲醛固定活細胞或者組織的方法,所以能比較真實的反映細胞內TF與Promoter的結合情況。當用甲醛處理時,相互靠近的蛋白與蛋白,蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產生共價鍵。細胞內,當TF與Promoter相互結合(生物意義上的結合)時,它們必然靠的比較近,或者契合在一起,這個時候用甲醛處理,能使它們之間產生共價鍵。染色質免疫沉淀分析(ChiP)是基于體內分析發展起來的方法,它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA復合物,并通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過抗原抗體的特異性識別反應沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。它能真實、完整地反映結合在DNA序列上的調控蛋白,是目前確定與特定蛋白結合的基因組區域或確定與特定基因組區域結合的蛋白質的一種很好的方法。CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且,CHIP與其他方法的結合,擴大了其應用范圍:CHIP與基因芯片相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩??;CHIP與體內足跡法相結合,用于尋找反式因子的體內結合位點;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達調控中的作用。一般ChIP的流程是:甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,并沉淀---對沉淀下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯,純化富集的DNA-片斷---PCR分析。在PCR分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP(其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,最后分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA);還有ChIP-chip(其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來準備樣品)。

 
 
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